《基因克隆載體》PPT課件(I)

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1、3基因克隆載體定義通過不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細(xì)胞且能在其中維持的DNA分子。也稱DNA克隆載體。必備條件1、克隆位點(diǎn)(一個(gè)或多個(gè))2、能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞:能自我復(fù)制，或整入染色體隨受體細(xì)胞DNA復(fù)制而復(fù)制。3、有選擇克隆子的標(biāo)記基因4、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細(xì)胞)意義：基因工程隨載體系統(tǒng)的建立而興起，構(gòu)建新載體一直是基礎(chǔ)研究的優(yōu)先領(lǐng)域。按克隆載體的來源分：質(zhì)粒～病毒或噬菌體～質(zhì)粒與病毒或噬菌體DNA組成的～質(zhì)粒與染色體DNA片段組成的～按應(yīng)用范圍分：表達(dá)型～啟動(dòng)子探針型～cD

2、NA～按應(yīng)用對(duì)象分：原核生物～植物～動(dòng)物～分類３.１質(zhì)?？寺≥d體定義：以質(zhì)粒DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的載體，適于原核和植物的基因轉(zhuǎn)移、建立基因組文庫和cDNA基因文庫。一、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的性質(zhì)１、組成與構(gòu)型是染色體外裸露的雙鏈DNA分子（細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻、綠藻）構(gòu)型：l-DNAoc-DNAccc-DNA２、分子大?。?00～102kb３、復(fù)制特點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)；單向；質(zhì)粒和宿主細(xì)胞雙重遺傳系統(tǒng)控制復(fù)制強(qiáng)度：拷貝數(shù)（細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒與染色體數(shù)量之比值）（１）每種質(zhì)粒在其宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)相對(duì)穩(wěn)定嚴(yán)緊控制型：1~數(shù)個(gè)拷貝；大質(zhì)粒松馳控制型：10個(gè)以上拷貝

3、；小質(zhì)粒。經(jīng)氯霉素處理，宿主中質(zhì)粒大量擴(kuò)增（如ColE1拷貝數(shù)達(dá)3000個(gè)）。（２）質(zhì)粒復(fù)制的控制因素cop基因：指令宿主合成阻遏物，當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定拷貝數(shù)時(shí)，阻遏物也合成積累，直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復(fù)制。rep基因：指令宿主合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)質(zhì)粒的復(fù)制par序列：附著在細(xì)胞膜上，使質(zhì)粒隨細(xì)胞分裂而正確地分配到子細(xì)胞中，維持相對(duì)穩(wěn)定的拷貝數(shù)４、質(zhì)粒的不親合性親和性質(zhì)粒：能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒不親和性（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒意義：宿主細(xì)胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒５、質(zhì)粒遷移（１）

4、接合質(zhì)粒：含tra基因→合成細(xì)胞表面物質(zhì)（鞭毛）→質(zhì)粒DNA入受體細(xì)胞含tra基因的質(zhì)粒稱為接合質(zhì)粒。如F、Ti等不含tra基因的質(zhì)粒稱為非接合質(zhì)粒。如ColE1、pPbS等（２）遷移作用不含tra基因而含bom（oriＴ）位點(diǎn)的質(zhì)粒，當(dāng)宿主細(xì)胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物時(shí)，即可打開oriＴ位點(diǎn)，非結(jié)合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細(xì)胞。這種現(xiàn)象稱～質(zhì)粒的遷移作用６、顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱為顯性（表達(dá)型）質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒Ｒ質(zhì)粒：含有氨芐青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四環(huán)素Tc、鏈霉素Sm等藥

5、物的抗性基因，可作為選擇標(biāo)記。Col質(zhì)粒Ｆ質(zhì)粒降解質(zhì)粒Ｔi質(zhì)粒隱蔽質(zhì)粒藍(lán)藻內(nèi)源質(zhì)粒二、質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建的基本策略１、能進(jìn)行有效復(fù)制——復(fù)制起始位點(diǎn)（最好是多拷貝）２、克隆位點(diǎn)——組裝MCS連桿３、選擇標(biāo)記基因——抗性基因，LacZ’基因４、分子盡可能?。ㄞD(zhuǎn)化率高），＞15kb，轉(zhuǎn)化率↓↓５、組裝各種“元件”，如啟動(dòng)子、終止子等三、質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建過程：嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)→構(gòu)建（切割、修飾和連接重組）構(gòu)建原則1、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒：含必備的元件，如ori、選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)、啟動(dòng)子和終止子2、正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件3、組裝合適的選擇標(biāo)記基因

6、4、選用合適的啟動(dòng)子5、構(gòu)建過程力求簡(jiǎn)單代表性實(shí)例。（一）pBR322及其衍生質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建Ⅰ、pBR322構(gòu)建質(zhì)粒載體命名法則“pBR322”p：質(zhì)粒（plasmid)BR：兩位主要構(gòu)建者322：實(shí)驗(yàn)編號(hào)pSC101（最早用于DNA克隆的載體），嚴(yán)緊型ColE1松馳型，篩選系統(tǒng)復(fù)雜構(gòu)建過程(出發(fā)質(zhì)粒：pMB1)R1（沙門氏菌中分離）變異R1drd19（含易位子Tn3Apr）R1drd19Tn3pSF2124ColE1pBR322的三個(gè)親本：pMB1、pSF2124、pSC101識(shí)別位點(diǎn)：Apr基因區(qū)（3個(gè)）：PstⅠ、ScaⅠ、PvuⅠ

7、Tcr基因區(qū)（7個(gè)）：BamHⅠ、ScalⅠ、EcoRⅤ、SphⅠ、NheⅠ、NruⅠ、XmaⅢTcr啟動(dòng)子區(qū)（2個(gè)）：ClaⅠ、HindⅢpBR322分子大?。?363bp3、優(yōu)點(diǎn)（1）較小的分子量10kb以內(nèi)DNA分子純化過程中可避免斷裂，pBR322易于自身純化，且可克隆6kb左右的外源DNA（2）較高的拷貝數(shù)經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)培后達(dá)1000～3000copys/cell（3）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。插入失活（圖解）Ⅱ、pUC18/19質(zhì)粒載體與pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個(gè)DNA片段（lacZ`基因）替換Tcr基因；

8、組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）連桿命名pUC——UniversityofCalifornia的科學(xué)家首先構(gòu)建。圖3-3。pUC包括四個(gè)組成部分：（1）pBR322的