淺談洗板對(duì)ELISA試驗(yàn)的影響

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淺談洗板對(duì)ELISA試驗(yàn)的影響作者：薩冬芝，楊桂芬等來源：《獸醫(yī)導(dǎo)刊》2019年第3期2018年11月14日，我中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行犬細(xì)粒棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)試驗(yàn)。試驗(yàn)由2名實(shí)驗(yàn)員操作，另有3名見習(xí)實(shí)驗(yàn)員輔助。犬細(xì)粒棘球絳蟲抗原檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：Eg-Ag20180620）由上級(jí)單位統(tǒng)一配發(fā)。274份犬糞樣品事先經(jīng)﹣70℃冷凍一周處理，試驗(yàn)當(dāng)日室溫解凍后每份取1g樣品，加1ml樣品處理液，4000rpm離心15min待用。試驗(yàn)用儀器：酶標(biāo)儀正常，培養(yǎng)箱正常，96孔自動(dòng)洗板機(jī)開機(jī)沖洗管路正常。實(shí)驗(yàn)員甲操作A、B兩塊包被板184份樣品的試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)員乙操作C塊包被板90份樣品的試驗(yàn)。試驗(yàn)過程嚴(yán)格按著試劑盒說明書逐步進(jìn)行，洗板過程中習(xí)慣性的同一方向放入包被板，合上蓋子洗板，未察覺異常。試驗(yàn)結(jié)束，結(jié)果均成立。但三塊包被板之間出現(xiàn)非常相似的陽性結(jié)果，即A、B、C各板的D—12、E—12、G—12三孔均顯陽性（另有A板B—12孔為陽性），且C板G—12孔無樣品仍顯陽性。這樣的結(jié)果引起我們的注意，回憶操作過程未出現(xiàn)遺漏、失誤，檢查洗板機(jī)發(fā)現(xiàn)D—12、E—12、G—12對(duì)應(yīng)的針孔堵塞，不出液體。這樣能解釋為什么不同的人操作不同的反應(yīng)板出現(xiàn)高度相似的結(jié)果，且無樣品孔也出現(xiàn)陽性。查出問題后，疏通洗板機(jī)針孔，隨即對(duì)全部樣品按原樣進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果為A板B—12孔為陽性，有異議的各板D—12、E—12、G—12三孔均顯陰性（其中C板G—12孔無樣品）。該試驗(yàn)由抗細(xì)粒棘球絳蟲特異性抗體包被的微孔板和酶標(biāo)記抗棘球絳蟲特異性抗體，以雙抗體夾心法檢測(cè)犬糞便中細(xì)粒棘球絳蟲抗原。試驗(yàn)中，加入待檢樣品，經(jīng)過溫育后，若樣品中含有細(xì)粒棘球絳蟲抗原，則與包被板上的抗體結(jié)合，經(jīng)洗滌后除去未結(jié)合的抗原，再加入酶標(biāo)記物，與包被板上的抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合形成抗體-抗原-酶標(biāo)記物復(fù)合物，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，在微孔中加入顯色液，經(jīng)酶催化形成的藍(lán)色信號(hào)與樣品中的抗原含量成正比。本次試驗(yàn)中由于洗板機(jī)的故障，洗板過程中個(gè)別孔洗滌不充分或未得到洗滌，使得微孔中的酶標(biāo)記物留存，導(dǎo)致加入顯色液后，酶催化底物成為有色產(chǎn)物而最終顯陽性。洗滌在ELISA試驗(yàn)過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著試驗(yàn)的成敗。洗板達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)，以供最終檢測(cè)。筆者認(rèn)為在ELISA試驗(yàn)過程中，洗滌對(duì)試驗(yàn)的影響主要有以下幾點(diǎn)（除去本次試驗(yàn)中洗板機(jī)針孔堵塞情況）。一、注液量如果試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)較多的假陽性，可以懷疑是洗板未洗干凈造成的，那么就需要將注液量調(diào)大，最好是注滿整個(gè)孔。注液量太少洗不到微孔較高的位置，而這些位置可能也有殘留的待檢測(cè)物質(zhì)，從而使最終結(jié)果出現(xiàn)假陽性。ELISA微孔板的廠家一般會(huì)在試劑盒的說明書中寫明建議使用的注液量（300μl）。一般來說，注液量越大，則殘留的抗體或抗原量就越少。增大注液量最直接的方法是注入過量的洗滌液，現(xiàn)有先進(jìn)的洗板機(jī)會(huì)有防溢液功能，當(dāng)注液過量時(shí)多余洗液會(huì)自動(dòng)被吸走，不會(huì)流到板架和儀器內(nèi)。二、洗板次數(shù)和洗板強(qiáng)度第二個(gè)影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗板次數(shù)和洗板強(qiáng)度。洗板次數(shù)越多，洗板強(qiáng)度越大，殘留量也就越低。但是洗板次數(shù)過多或洗板強(qiáng)度過大可能會(huì)破壞已包被的固相載體，反而使檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。有時(shí)候也會(huì)遇到一些特殊情況的試劑，比如游離的物質(zhì)吸附性較強(qiáng)，較難洗凈，

1這時(shí)就需要增大洗板強(qiáng)度或洗板次數(shù)；或者恰恰相反，參與結(jié)合的固相載體不是特別牢固，容易被沖洗掉，這時(shí)就需要減弱洗板強(qiáng)度或減少洗板次數(shù)。通常ELISA微孔板的廠家也會(huì)在說明書中注明建議的洗板次數(shù)。三、吸液高度和吸液位置最后一個(gè)影響洗板效果的參數(shù)就是吸液高度和吸液位置，吸液高度會(huì)明顯影響殘留量，如果吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大，那就會(huì)讓殘留量急劇增加。反之，如果吸頭壓著反應(yīng)孔底部，液體比較難進(jìn)入吸頭，那么也會(huì)使吸液效率降低，殘留量增加。大多數(shù)洗板機(jī)會(huì)使用浮動(dòng)的洗板頭，這種洗板頭有一定的自由調(diào)節(jié)空間，下降到微孔底部，接觸后會(huì)自然頂起一部分，不需要根據(jù)不同的微孔板設(shè)置不同的吸液高度，而是直接下降到微孔底部進(jìn)行吸液。吸液的位置也對(duì)殘留量有著重要影響。如果每個(gè)孔只使用一個(gè)抽吸點(diǎn)，也就是一點(diǎn)吸液，那么吸液的位置是非常重要的。這個(gè)位置最好設(shè)置在微孔的中間位置，這樣整個(gè)孔中的液體抽吸過程比較均勻。還有的廠家設(shè)置為兩點(diǎn)吸液，就是在孔中心與孔壁之間的某處取前后兩點(diǎn)進(jìn)行吸液，使殘留量降到最小。本次試驗(yàn)由于人員的疏忽導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，也警示實(shí)驗(yàn)室人員在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)于每一步都要嚴(yán)謹(jǐn)、細(xì)致。并且在洗板過程中不要隨意更改說明書中建議的洗板參數(shù)。