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1、重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文谷胱甘肽--S--轉(zhuǎn)移酶抑制劑設(shè)計(jì)、合成及篩選姓名:張靈申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):藥物化學(xué)指導(dǎo)教師:楊曉蘭201205重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文谷胱甘肽.s-轉(zhuǎn)移酶抑制劑設(shè)計(jì)、合成及篩選摘要谷胱甘肽.S.轉(zhuǎn)移酶(glutathione.S.transferases,GST)主要存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi),是由相同亞基構(gòu)成的二聚體;每個(gè)亞基有一個(gè)活性中心,包含谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)(G.site)和相鄰疏水底物結(jié)合位點(diǎn)(H.site)。GST抑制劑可增強(qiáng)細(xì)胞毒性藥物抗腫瘤療效或直接抑制腫瘤生長,因此,GST抑制劑的設(shè)計(jì)與篩選成為研究的重點(diǎn)。本文提取制備豬肝酸。I'生G
2、ST同工酶,建立酶促動(dòng)力學(xué)測定GST抑制劑抑制能力方法,同時(shí)設(shè)計(jì)合成一系列GST抑制劑并進(jìn)行了篩選。1豬肝酸性GST同工酶制備及表征從豬肝經(jīng)陰離子交換層析和親和層析制備GST酸性同工酶,此GST被純化146倍以上,活性總收率近30%。該GST對GSH和CDNB的‰分別為42btmol/L和O.86mmol/L,屬于隨機(jī)雙底物動(dòng)力學(xué)模型。2谷胱甘肽.S.轉(zhuǎn)移酶酶促動(dòng)力學(xué)測定其抑制劑抑制能力的方法用還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和1一氯一2,4-二硝基苯(1-chloro.2,4.dinitrobenzene,CDNB)合成m-(2,4-二硝基苯基)一谷胱甘肽(G
3、S.DNB)為候選抑制劑,以GSH與CDNB為底物測定GST在GS.DNB作用下的米氏常數(shù)(‰)和最大反應(yīng)速度(%),從而確定GS—DNB對GST的抑制常數(shù)(墨)。GS.DNB對CDNB競爭性廚為(21士1)肛rnol/L(刀=2);對GSH競爭性膨?yàn)?17土1)lamol/L∽=2)。產(chǎn)物GS—DNB是GST的高親和力競爭性抑制劑;測定GST動(dòng)力學(xué)參數(shù)隨抑制劑濃度的變化可篩選其抑制劑。3谷胱甘肽.S.轉(zhuǎn)移酶抑制劑的設(shè)計(jì)與篩選通過對參考文獻(xiàn)以及脂水分配系數(shù)(LogP)等相關(guān)化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考1重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文查,主要從兩條途徑對GST抑制劑進(jìn)行設(shè)計(jì):一、參照GS.DN
4、B的設(shè)計(jì)思路,針對G.位點(diǎn)和H.site雙位點(diǎn)設(shè)計(jì)產(chǎn)物型抑制劑I,即以對氨基苯甲酸作為原料衍生的一疏水化合物與GSH的加合物;二、針對H.site可結(jié)合基團(tuán)設(shè)計(jì)較大體積疏水抑制劑,用依他尼酸(ethacrvnicacid,EA),4.丁基苯甲酸,3,5.二甲基苯甲酸,丹磺酰氯等羧酸作為功能基,1,3.丙二胺、1,5.戊二胺、賴氨酸和1,4.丁二胺作為連接臂,得到對稱雙酰胺類疏水型抑制劑II。通過酶促動(dòng)力學(xué)初速度法測定合成的GST抑制劑挺進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)大體積的II類抑制劑比I類抑制劑抑制能力強(qiáng);2)II類抑制劑中N,N’.雙依他尼酰.1,4.丁二胺和N,N’.雙對丁基苯
5、甲酰.1,4.丁二胺都為GST相對GSH的強(qiáng)競爭性抑制,抑制常數(shù)分別為38nmol/L和0.28Itmol/L??梢姡瑢⒌陀H和力GST抑制劑用柔性短鏈連成對稱結(jié)構(gòu),有望獲得高親和力GST抑制劑。總之,建立了通過酶促動(dòng)力學(xué)篩選GST抑制劑的方法,通過設(shè)計(jì)合成并篩選,發(fā)現(xiàn)較高的親和力新型抑制劑,這為發(fā)現(xiàn)新的GST抑制劑作為抗腫瘤藥物增敏劑奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:谷胱甘肽.S.轉(zhuǎn)移酶;酶促動(dòng)力學(xué);抑制劑;抑制常數(shù)4重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文一DESIGN,SYNTHESISANDSCREENINGOFGlutathione-S-transferase(glutathione—S-tra
6、nsferases,GST)asagroupproteinwithavarietyofbiologicalfunctionswidelyexistinmammals,Itfeaturesasadimeroftwocomposedofidenticalsubunits;eachsub-basehasanactivitycenter,composedofglutathionebindingsite(G-site)andadjacentsparseunderwaterobjectsbindingsites(H-site).GSTinhibitorsmayenhancetheantit
7、umorefficacyofcytotoxicdrugsordirectlyinhibittumorgrowth.Therefore,thedesignandscreeningofGSTinhibitorsbecomethefocusofthestudy.ThispaperformulatedtheenzymekineticsmethodforthedeterminationinhibitioncapacityofGSTinhibitors,screenedtwoseriesofGSTinh