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1、豬FcγRI的可變剪接及其對(duì)PRRSVADE效應(yīng)的調(diào)控作用TheeffectsofalternativelysplicedporcineFcγRIonAntibody-dependentEnhancementofPRRSVinfection一級(jí)學(xué)科：生物學(xué)學(xué)科專業(yè)：生物學(xué)作者姓名：李藝指導(dǎo)教師：黃金海教授天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院二零一七年五月萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝之處外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得天津大學(xué)或其
2、他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定。特授權(quán)天津大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)說明）學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：簽字日期：年月日簽字日期：年月日萬方數(shù)據(jù)中文摘要豬繁殖與呼
3、吸綜合征俗稱“藍(lán)耳病”，是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的高度接觸性傳染病，嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。PRRSV具有抗體依賴性增強(qiáng)（Antibody-dependentenhancement,ADE）效應(yīng)，是造成持續(xù)性感染、免疫失敗及疫苗效果不佳的重要原因。FcγR是PRRSV靶細(xì)胞——豬肺泡巨噬細(xì)胞（Porcinealveolarmacrophages,PAM）上高表達(dá)的膜受體，通過結(jié)合病毒-抗體免疫復(fù)合物（Immuneco
4、mplex,IC），介導(dǎo)病毒ADE效應(yīng)，并參與免疫細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的調(diào)節(jié)及機(jī)體炎癥反應(yīng)。FcγR存在多種亞型，研究發(fā)現(xiàn)人和小鼠FcγR基因存在選擇性剪接，關(guān)于豬FcγRI的可變剪接及其參與PRRSVADE的機(jī)理尚不清楚。為了進(jìn)一步明確FcγRI在PRRSVADE效應(yīng)中的作用，本文通過體外細(xì)胞感染模型，研究了FcγRI的可變剪接特征，膜型及可溶型FcγRI在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞、抗原遞呈、致炎性作用中的功能，以及ADE特異性細(xì)胞應(yīng)答。這為理解FcγRI在PRRSVADE效應(yīng)中調(diào)控作用的分子機(jī)制和免疫應(yīng)答特征，認(rèn)識(shí)PRRSV獨(dú)特的致病及免疫機(jī)制提供了
5、證據(jù)。主要結(jié)果如下：（1）豬FcγRI存在多種轉(zhuǎn)錄剪接體：從3頭豬PAM細(xì)胞中克隆到多種FcγRI轉(zhuǎn)錄剪接體，與豬基因組的GenomeScan分析表明，豬FcγRI基因通過3'端可變剪接產(chǎn)生至少6種剪接體，包括2種膜型和4種缺失跨膜區(qū)、潛在分泌型的可溶型FcγRI。對(duì)3頭豬個(gè)體的原代PAM細(xì)胞及傳代細(xì)胞3D4/21中FcγRI的125個(gè)克隆分析表明，不同F(xiàn)cγRI轉(zhuǎn)錄剪接體普遍表達(dá)于多種體內(nèi)原代細(xì)胞及3D4/21體外培養(yǎng)細(xì)胞系。單基因測(cè)序分析表明，PAM細(xì)胞上的FcγRI主要以膜型為主，約占轉(zhuǎn)錄本的74%~91%，為優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄本。（2
6、）豬膜型FcγRI參與PRRSV-IC的內(nèi)化，介導(dǎo)PRRSVADE作用：將構(gòu)建的膜型、可溶型FcγRI真核表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染PRRSV敏感細(xì)胞3D4/21及非敏感細(xì)胞293T，通過FcγRI抗體阻斷實(shí)驗(yàn)、病毒載量測(cè)定、confocal觀察網(wǎng)格蛋白變化等，比較了PRRSVADE效應(yīng)下的細(xì)胞應(yīng)答，研究了膜型、可溶型FcγRI在PRRSVADE中的作用。利用相對(duì)熒光定量PCR、confocal方法發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)膜型FcγRI（pcDNA3.1-T1）可增強(qiáng)PRRSV-IC對(duì)3D4/21和293T細(xì)胞的感染，而可溶型FcγRI（pcDNA3.
7、1-T3）不具備介導(dǎo)PRRSVADE的能力。Confocal結(jié)果表明，膜型FcγRI通過增強(qiáng)網(wǎng)格蛋白的表達(dá)及募集，促進(jìn)成熟溶酶體的形成及轉(zhuǎn)運(yùn)，介導(dǎo)病毒內(nèi)化。Real-timePCR結(jié)果表明，高豐度的可溶型FcγRI轉(zhuǎn)錄表I萬方數(shù)據(jù)達(dá)，可上調(diào)PRRSVADE感染中IFN-β、TNF-α、IL-1β炎性因子及抗原遞呈分子MHC-I、II表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，負(fù)向調(diào)控PRRSVADE效應(yīng)。而膜型FcγRI的高表達(dá)，抑制了TLR7，下調(diào)了干擾素的產(chǎn)生。（3）PRRSV上調(diào)細(xì)胞中可溶型FcγRI比率，ADE作用抑制機(jī)體抗病毒反應(yīng)，影響靶細(xì)
8、胞應(yīng)答，增強(qiáng)FcγR介導(dǎo)的內(nèi)吞，抑制炎性因子轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)特異性TCRVβ細(xì)胞亞群增殖。研究了有、無PRRSV特異性抗體下PRRSV感染3D4/21細(xì)胞，幾種FcγR的轉(zhuǎn)錄變化，Real-timePCR顯示PRRSV僅上調(diào)了FcγRI的轉(zhuǎn)
