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1、豬FcγRI的可變剪接及其對PRRSVADE效應(yīng)的調(diào)控作用TheeffectsofalternativelysplicedporcineFcγRIonAntibody-dependentEnhancementofPRRSVinfection一級學(xué)科：生物學(xué)學(xué)科專業(yè)：生物學(xué)作者姓名：李藝指導(dǎo)教師：黃金海教授天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院二零一七年五月萬方數(shù)據(jù)獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝之處外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得天津大學(xué)或其
2、他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定。特授權(quán)天津大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)說明）學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：簽字日期：年月日簽字日期：年月日萬方數(shù)據(jù)中文摘要豬繁殖與呼
3、吸綜合征俗稱“藍耳病”，是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的高度接觸性傳染病，嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。PRRSV具有抗體依賴性增強（Antibody-dependentenhancement,ADE）效應(yīng)，是造成持續(xù)性感染、免疫失敗及疫苗效果不佳的重要原因。FcγR是PRRSV靶細胞——豬肺泡巨噬細胞（Porcinealveolarmacrophages,PAM）上高表達的膜受體，通過結(jié)合病毒-抗體免疫復(fù)合物（Immuneco
4、mplex,IC），介導(dǎo)病毒ADE效應(yīng)，并參與免疫細胞內(nèi)信號的調(diào)節(jié)及機體炎癥反應(yīng)。FcγR存在多種亞型，研究發(fā)現(xiàn)人和小鼠FcγR基因存在選擇性剪接，關(guān)于豬FcγRI的可變剪接及其參與PRRSVADE的機理尚不清楚。為了進一步明確FcγRI在PRRSVADE效應(yīng)中的作用，本文通過體外細胞感染模型，研究了FcγRI的可變剪接特征，膜型及可溶型FcγRI在介導(dǎo)細胞內(nèi)吞、抗原遞呈、致炎性作用中的功能，以及ADE特異性細胞應(yīng)答。這為理解FcγRI在PRRSVADE效應(yīng)中調(diào)控作用的分子機制和免疫應(yīng)答特征，認(rèn)識PRRSV獨特的致病及免疫機制提供了
5、證據(jù)。主要結(jié)果如下：（1）豬FcγRI存在多種轉(zhuǎn)錄剪接體：從3頭豬PAM細胞中克隆到多種FcγRI轉(zhuǎn)錄剪接體，與豬基因組的GenomeScan分析表明，豬FcγRI基因通過3'端可變剪接產(chǎn)生至少6種剪接體，包括2種膜型和4種缺失跨膜區(qū)、潛在分泌型的可溶型FcγRI。對3頭豬個體的原代PAM細胞及傳代細胞3D4/21中FcγRI的125個克隆分析表明，不同F(xiàn)cγRI轉(zhuǎn)錄剪接體普遍表達于多種體內(nèi)原代細胞及3D4/21體外培養(yǎng)細胞系。單基因測序分析表明，PAM細胞上的FcγRI主要以膜型為主，約占轉(zhuǎn)錄本的74%~91%，為優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄本。（2
6、）豬膜型FcγRI參與PRRSV-IC的內(nèi)化，介導(dǎo)PRRSVADE作用：將構(gòu)建的膜型、可溶型FcγRI真核表達載體，分別轉(zhuǎn)染PRRSV敏感細胞3D4/21及非敏感細胞293T，通過FcγRI抗體阻斷實驗、病毒載量測定、confocal觀察網(wǎng)格蛋白變化等，比較了PRRSVADE效應(yīng)下的細胞應(yīng)答，研究了膜型、可溶型FcγRI在PRRSVADE中的作用。利用相對熒光定量PCR、confocal方法發(fā)現(xiàn)，過表達膜型FcγRI（pcDNA3.1-T1）可增強PRRSV-IC對3D4/21和293T細胞的感染，而可溶型FcγRI（pcDNA3.
7、1-T3）不具備介導(dǎo)PRRSVADE的能力。Confocal結(jié)果表明，膜型FcγRI通過增強網(wǎng)格蛋白的表達及募集，促進成熟溶酶體的形成及轉(zhuǎn)運，介導(dǎo)病毒內(nèi)化。Real-timePCR結(jié)果表明，高豐度的可溶型FcγRI轉(zhuǎn)錄表I萬方數(shù)據(jù)達，可上調(diào)PRRSVADE感染中IFN-β、TNF-α、IL-1β炎性因子及抗原遞呈分子MHC-I、II表達，促進細胞的炎性反應(yīng)，負向調(diào)控PRRSVADE效應(yīng)。而膜型FcγRI的高表達，抑制了TLR7，下調(diào)了干擾素的產(chǎn)生。（3）PRRSV上調(diào)細胞中可溶型FcγRI比率，ADE作用抑制機體抗病毒反應(yīng)，影響靶細
8、胞應(yīng)答，增強FcγR介導(dǎo)的內(nèi)吞，抑制炎性因子轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)特異性TCRVβ細胞亞群增殖。研究了有、無PRRSV特異性抗體下PRRSV感染3D4/21細胞，幾種FcγR的轉(zhuǎn)錄變化，Real-timePCR顯示PRRSV僅上調(diào)了FcγRI的轉(zhuǎn)
