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1、GBclonart基因克隆技術191
2、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
3、4/23/2012傳統(tǒng)的分子克隆方法TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺點：連接效率低耗時較長需要特定限制性酶切位點202
4、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
5、4/23/2012April23,2012GBclonart克隆技術的優(yōu)點:?任意載體?任意基因片段?不附加任何多余序列?不受限制性內切酶酶切位點的限制213
6、GenebankBiosciencesProprietary&Confidenti
7、al
8、4/23/2012April23,2012GBclonart基因克隆技術原理示意圖4250℃，30min單管反應GBclonart是一種快速、簡單、高效的基因克隆技術！224
9、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
10、4/23/2012GBclonart基因克隆特點1.連接效率很高當前產品質量不符合要求，特別是buffer對連接的效率影響特別大，還有好多奸商購進別的公司的產品然后回來稀釋賣出。2.背景低T4連接有時候背景很高，如果遇到特別的基因還很難連接進去，而LIC連接要對載體進行特殊的改造，這樣對一些特殊的構建就有一定
11、的局限性，而GBclonart可以做到克服這樣的困難。3.特殊連接這種方法，對于一些特殊的鏈接特別有幫助，如你片段里有很多酶切位點，你在苦苦需找用什么酶切的時候，浪費了你的好多腦細胞，而這種方法的好處是不用考慮你片段有什么酶切位點，只要考慮你在載體什么位點插入就可以了。4.多片段的鏈接5
12、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
13、4/23/2012克隆成功的關鍵?線性化載體制備?引物設計、PCR條件?克隆反應設置?克隆感受態(tài)細胞的選擇?選用質量好的膠回收或PCR純化試劑盒6
14、GenebankBiosciencesPropriet
15、ary&Confidential
16、4/23/2012載體線性化:雙酶切處理PCR擴增采用酶切或PCR擴增方法將載體線性化。質粒的線性化不徹底將導致陰性克隆的產生，所以一般建議通過雙酶切。如使用PCR擴增獲得線性化質粒，所用的酶應選用高保真酶（如Pfu酶）。7
17、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
18、4/23/2012April23,2012引物設計要點：1)引物的5’末端必須包含與載體末端相同的15個堿基序列2)引物的3’末端必須包含與目的基因片段相互補的特異堿基序列8
19、GenebankBiosciencesProprieta
20、ry&Confidential
21、4/23/2012克隆策略——對PCR片段的處理PCR產物有無雜帶？有無引物二聚體？均有或有雜帶無雜帶，有引物二聚體GelExtractionKitPCRPurificationKit均無基因克隆、轉化9
22、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
23、4/23/2012Gbclonart重組反應目的基因片段線性化載體GBclonart重組反應42℃30min反應液直接轉化重組酶體系GBclonart反應液15μl重組反應：線性化載體xμlPCR片段xμl———總體積20μl10
24、GenebankBio
25、sciencesProprietary&Confidential
26、4/23/2012GBclonart無縫克隆結果：陽性I.線性化載體II.PCR片段III.反應產物陰性對照GBclonart反應液15μl線性化載體xμlPCR片段xμl———總體積20μl11
27、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
28、4/23/2012GBclonart無縫克隆注意事項：如何選擇PCR酶？使用任何PCR酶都可以，但推薦使用高保真Pfu酶。PCR產物的結構有限制嗎？沒有特別的限制。PCR產物末端有無A尾都能使用。載體末端的結構有限制嗎？沒有特別
29、的限制。載體末端是平滑末端或是粘性末端都能使用。引物附加序列如果不是15個堿基可以嗎？引物附加序列為15～20個堿基都可以。GBclonart試劑盒的保存應注意什么？-20℃或-80℃保存。12
30、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
31、4/23/2012
