植物基因克隆技術(shù)及其發(fā)展

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1、世界農(nóng)業(yè)WorldAgriculture200012(總250)基因是染色體上具有一因。定座位的遺傳單位,是21通過遺傳表型分析DNA分子中一定長度的核植(1)基因標(biāo)鑒法。該法苷酸序列。植物的生長發(fā)育是利用轉(zhuǎn)座子或T-DNA是在多種代謝和生理過程基物插入植物的基因組中引起某礎(chǔ)上所發(fā)生的基因在時空上一基因失活產(chǎn)生一些突變表達(dá)的綜合現(xiàn)象,開發(fā)和分基體,然后用相應(yīng)轉(zhuǎn)座子或離潛在的各種有價值的基因浙T-DNA對突變體文庫進(jìn)江并深入研究其表達(dá)機(jī)理,對因行篩選,以選到的陽性克隆大作物品種的改良具有重要意學(xué)片段為探針,再篩選野生

2、型農(nóng)義。因此對植物基因的克隆克植物的基因文庫分離目的基業(yè)并發(fā)展與之相關(guān)的技術(shù)已引和因。如將一株帶有功能的轉(zhuǎn)起人們的日益關(guān)注和投入,隆生位因子系統(tǒng)的植物與另一株物近年來其研究方法不斷改技在遺傳上有差異的同種植物進(jìn),新技術(shù)不斷涌現(xiàn),這為技術(shù)雜交,在雜交后代中篩選由學(xué)進(jìn)一步研究諸如各種調(diào)節(jié)植院于轉(zhuǎn)位因子插入到某一特定物生長發(fā)育的基因、逆境與術(shù)基因序列中導(dǎo)致表型破壞或俞防御反應(yīng)的基因、植物細(xì)胞改變的突變株,用該純合突志凋亡的基因等提供了新的途及華變株構(gòu)建基因文庫,然后將徑。轉(zhuǎn)位因子用同位素標(biāo)記作探其針,從該文庫中篩選出帶有

3、一、常用的目的同源轉(zhuǎn)位因子的目的基因。基因克隆技術(shù)發(fā)該法主要限于二倍體的自花11通過已知基因產(chǎn)物授粉作物如玉米、金魚草的分析和鑒定展等。應(yīng)用該法已分離出與玉這類技術(shù)主要通過生物米種子發(fā)育有關(guān)的Vivipar2化學(xué)和病理學(xué)研究分離鑒定ious-l基因及與金魚草花有關(guān)基因的蛋白產(chǎn)物,并對蛋白質(zhì)氨基酸順序發(fā)育有關(guān)的一些基因等。進(jìn)行分析,推斷出編碼該蛋白質(zhì)的基因序列,(2)激發(fā)子的寄主受體基因克隆技術(shù)。該然后通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備技術(shù)是利用病菌無毒基因(avrgene)編碼的激的探針對文庫進(jìn)行篩選來分離目的基

4、因。如植發(fā)子與寄主抗病基因編碼的受體之間存在不親物抗病蟲基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲晶和的互作關(guān)系,以病原激發(fā)子蛋白為線索分離體蛋白基因(Bt基因)、豇豆胰蛋白酶抑制基和克隆寄主中的受體蛋白基因。應(yīng)用該技術(shù)已因(CpTI基因)、病毒外殼蛋白基因(CP基分離和克隆出一些幾丁質(zhì)抗病基因,如番茄與因)等。當(dāng)其他植物的同類基因已分離到并且無毒基因avr9對應(yīng)的抗病基因cf9,與avrP2核苷酸序列保守性較高時,也可直接用這些已to對應(yīng)的抗病基因pto;擬南芥菜與avrRPS2知的基因片段作探針對未克隆到該基因的植物對應(yīng)的

5、抗病基因rpS2等?；蛭膸爝M(jìn)行篩選,也可分離到未知的新基31以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)-37-200012(總250)世界農(nóng)業(yè)WorldAgriculture以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)在分離未知探針與親本DNA或核DNA文庫雜交,確定產(chǎn)物的基因方面有廣闊的應(yīng)用前景。該法的基出這些DNA片段所編碼的基因。應(yīng)用上述方本前提是基因定位,然后以緊密連鎖的分子標(biāo)法已分離出擬南芥菜與赤霉素合成有關(guān)的基因記如RFLP等為起點,通過染色體步移逐步gal以及冰草的鹽脅迫誘導(dǎo)基因等。向目標(biāo)基因靠近,最終克隆基因。其主要步驟21從大的

6、基因組區(qū)域直接分離編碼序列包括:(1)將目標(biāo)基因定位在高密度的分子標(biāo)真核生物基因組DNA中只有很小一部分記連鎖群上;(2)利用PFGE將連鎖標(biāo)記的遺編碼mRNA,而大部分則為內(nèi)含子、外顯子傳圖距轉(zhuǎn)換成物理距離;(3)構(gòu)建YAC文和重復(fù)序列,目前通過大規(guī)?；蚪M測序來尋庫,找到含連鎖標(biāo)記的YAC克隆,并通過克找和克隆新基因尚不可行。在已有一些分離表隆的排序獲得目標(biāo)基因的DNA片段;(4)通達(dá)序列的方法中,cDNA捕捉法是較成功的一過轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)試驗證實基因所在的DNA種方法,已用于許多基因的定位克隆。片段。如用該技

7、術(shù)已分離出番茄抗根結(jié)線蟲(1)cDNA文庫差示篩選法。這是一種直接mi基因和擬南芥菜抗細(xì)菌性莖腐病的RPMl分離組織或發(fā)育特異表達(dá)基因的方法。例如對基因等。于兩種不同的組織細(xì)胞,先提取它們的poly+(A)mRNA,分別構(gòu)建這兩種組織的cDNA二、發(fā)展中的基因克隆新技術(shù)文庫,然后以這些mRNA為模板,合成放射性11從研究缺失突變體的表型著手分離基標(biāo)記的cDNA探針,再用這兩種探針分別與一因類cDNA文庫的兩套重復(fù)考貝雜交,跟兩種探(1)核DNA消減法。該法主要是利用許針都雜交的克隆是兩種組織細(xì)胞中都表達(dá)的基多缺失突

8、變體與其未缺失的同源親本只有1～因,而僅與一種探針雜交的克隆則是在一種組2個DNA片段的差異,通過將大量特殊標(biāo)記織細(xì)胞中特異表達(dá)的mRNA,再對這樣的克隆的突變體DNA與少量未缺失親本DNA相混進(jìn)行測序比較和鑒定,就可分離到這種組織特合,變性后在適當(dāng)溫度下復(fù)性,待反應(yīng)體系中異表達(dá)的基因。用這種方法已分離到許多根莖的單鏈DNA重新配對成雙鏈后,除去標(biāo)記的葉和生