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《植物基因克隆技術(shù)及其發(fā)展方向》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、植物基因克隆技術(shù)及其發(fā)展方向摘要：基因是染色體上具有一定座位的遺傳單位，是DNA分子中一定長度的核苷酸序列。植物的生長發(fā)育是在多種代謝和生理過程基礎(chǔ)上所發(fā)生的基因在時(shí)空上表達(dá)的綜合現(xiàn)象，開發(fā)和分離潛在的各種有價(jià)值的基因并深入研究其表達(dá)機(jī)理，對(duì)作物品種的改良具有重要意義。因此對(duì)植物基因的克隆并發(fā)展與之相關(guān)的技術(shù)已引起人們的日益關(guān)注和投入，近年來其研究方法不斷改進(jìn)，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，這為進(jìn)一步研究諸如各種調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的基因、逆境與防御反應(yīng)的基因、植物細(xì)胞凋亡的基因等提供了新的途徑。關(guān)鍵詞：植物基因克隆基因植物基因轉(zhuǎn)化正文:植物基因的
2、克隆技術(shù)是生命科學(xué)研究的重要組成部分,是現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)中最核心的內(nèi)容,它是隨著20世紀(jì)70年代初DNA體外重組技術(shù)的發(fā)明而發(fā)展起來的,其目標(biāo)是識(shí)別和分離特異基因并獲得基因完整序列,確定其在染色體上的位置,闡明其生化功能,并利用生物工程手段應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中。一、常用的目的基因克隆技術(shù) 1、1、通過已知基因產(chǎn)物的分析和鑒定 這類技術(shù)主要通過生物化學(xué)和病理學(xué)研究分離鑒定有關(guān)基因的蛋白產(chǎn)物，并對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸順序進(jìn)行分析，推斷出編碼該蛋白質(zhì)的基因序列，然后通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對(duì)文庫進(jìn)行篩選來分離目的基因。如植物抗
3、病蟲基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當(dāng)其他植物的同類基因已分離到并且核苷酸序列保守性較高時(shí)，也可直接用這些已知的基因片段作探針對(duì)未克隆到該基因的植物基因文庫進(jìn)行篩選，也可分離到未知的新基因?！ ?、通過遺傳表型分析 （1）基因標(biāo)鑒法。該法是利用轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產(chǎn)生一些突變體，然后用相應(yīng)轉(zhuǎn)座子或T-DNA對(duì)突變體文庫進(jìn)行篩選，以選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫分離目的基因。如將一株帶有功
4、能的轉(zhuǎn)位因子系統(tǒng)的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交后代中篩選由于轉(zhuǎn)位因子插入到某一特定基因序列中導(dǎo)致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構(gòu)建基因文庫，然后將轉(zhuǎn)位因子用同位素標(biāo)記作探針，從該文庫中篩選出帶有同源轉(zhuǎn)位因子的目的基因。該法主要限于二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚草等。應(yīng)用該法已分離出與玉米種子發(fā)育有關(guān)的Viviparious-1基因及與金魚草花發(fā)育有關(guān)的一些基因等。 ?。?）激發(fā)子的寄主受體基因克隆技術(shù)。該技術(shù)是利用病菌無毒基因（avrgene）編碼的激發(fā)子與寄主抗病基因編碼的受體之間存在不親和的互作關(guān)
5、系，以病原激發(fā)子蛋白為線索分離和克隆出一些幾丁質(zhì)抗病基因，如番茄與無毒基因avr9對(duì)應(yīng)的抗病基因cf9，與avrPto對(duì)應(yīng)的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對(duì)應(yīng)的抗病基因rpS2等?！ ?、以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù) 以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)在分離未知產(chǎn)物的基因方面有廣闊的應(yīng)用前景。該法的基本前提是基因定位，然后以緊密連鎖的分子標(biāo)記如RFLP等為起點(diǎn)，通過染色體步移逐步向目標(biāo)基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標(biāo)基因定位在高密度的分子標(biāo)記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷標(biāo)記的遺傳圖譜距轉(zhuǎn)換成物理距離；（
6、3）構(gòu)建YAC文庫，找到含連鎖標(biāo)記的YAC克隆，并通過克隆的排序獲得目標(biāo)基因的DNA片段；（4）通過轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)基因所在的DNA片段。如用該技術(shù)已分離出番茄抗根結(jié)線蟲mi基因和擬南芥菜抗細(xì)菌性莖腐病的RPM1基因等。二、發(fā)展中的基因克隆新技術(shù) 1、1、從研究缺失突變體的表型著手分離基因 ?。?）核DNA消減法。該法主要是利用許多缺失突變體與其未缺失的同源親本只有1-2個(gè)DNA片段的差異，通過將大量特殊標(biāo)記的突變體DNA與少量未缺失親本DNA相混合，變性后在適當(dāng)溫度下復(fù)性，待反應(yīng)體系中的單鏈DNA重新配對(duì)成雙鏈后，除去標(biāo)
7、記的突變體DNA和與之雜交配對(duì)的親本DNA。如此幾輪選擇后，反應(yīng)體系中最后只剩下在突變體核DNA中所缺失的那一段親本DNA，最后對(duì)親本特異DNA片段進(jìn)行克隆?！ ?2)核DNA消減--PCR法。該法是核DNA消減法的發(fā)展，它將經(jīng)特定限制性內(nèi)切酶處理的未缺失親本DNA（備測(cè)DNA）與大量經(jīng)超聲波切割、光敏生物素標(biāo)記的突變體DNA(減法探針DNA)混合，經(jīng)變性復(fù)性后加抗生物素蛋白包裹的多聚乙烯小球懸浮液除去各種雜合體，富集的親本特異性DNA再經(jīng)幾輪篩選后加接頭序列和T4DNA連接酶，然后加入單鏈接頭序列作PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后
8、PCR產(chǎn)物直接克隆或32P標(biāo)記后作探針與親本DNA或核DNA文庫雜交，確定出這些DNA片段所編碼的基因，應(yīng)用上述方法已分離出擬南芥菜與赤霉素合成有關(guān)的基因gal以及冰草的鹽脅迫誘導(dǎo)基因等?！ ?、從大的基因組區(qū)域直接分離編碼序列 真核生物基因組D
