《基因克隆載體》word版

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1、I逆境脅迫因子主要有干旱、鹽漬、低溫、水澇等，是限制植物生長和區(qū)域分布以及影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素。植物對這些逆境脅迫的適應(yīng)主要被轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)基因（諸如控制多重抵御的酶、蛋白等）所介導(dǎo)?，F(xiàn)有研究證明，與轉(zhuǎn)錄因子活力有關(guān)聯(lián)的是轉(zhuǎn)錄輔激活子，它能增強轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件的結(jié)合。MBF1是一個轉(zhuǎn)錄輔激活子，通過一個激活物和一個TATA盒結(jié)合蛋白的橋連作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活。MBF1基因最早是在蠶、果蠅等動物體中被發(fā)現(xiàn)，后來在植物中也發(fā)現(xiàn)了MBF1基因。據(jù)報道，在擬南芥中的MBF1基因的超表達能增強其抵抗

2、逆境脅迫的能力，而在番茄中關(guān)于此基因還沒有相關(guān)的報道，本論文擬通過在番茄中超表達MBF1基因研究其對逆境脅迫的抗性能力，從而明確MBF1基因的分子作用機制，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：1.番茄MBF1基因的克隆以AC++番茄果實的總RNA為模板，體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，通過PCR擴增得到得632bp大小的片段，將其命名為LeMBF1，并登錄NCBIGenBank，登錄號為EF051474。將其與擬南芥中的MBF1基因進行同源性比較，在DNA水平上的序列相似性為56%，在氨基酸水平上的序列相

3、似性為82%，是一個新基因。2.Northern雜交技術(shù)分析番茄LeMBF1基因的表達特性克隆番茄MBF1（LeMBF1）基因特異片段，以此作為探針,通過Northern雜交技術(shù)分析LeMBF1基因的表達特性，結(jié)果顯示LeMBF1基因的表達能被高溫、干旱誘導(dǎo)，被復(fù)水所抑制；傷害處理能誘導(dǎo)WT番茄葉片中該基因的表達，對Nr番茄葉片中該基因的表達基本無影響，抑制rin番茄葉片中該基因的表達；外源乙烯處理綠熟期果實，LeMBF1基因的表達變化不明顯，說明在這一時期外源乙烯并不誘導(dǎo)LeMBF1基因的表達。3.雙

4、元超表達載體pBIN19-MBF1的構(gòu)建驗證的LeMBF1基因與經(jīng)PstI酶切的pDH51載體通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)經(jīng)PCR以及酶切鑒定確為重組中間載體質(zhì)粒，且外源片段方向正確，命名為pDH51-MBF1。中間載體pDH51-MBF1經(jīng)EcoRI酶切獲得了包含35S啟動子、MBF1基因、35S終止子的片段，此片段與經(jīng)EcoRI酶切的pBIN19載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)PCR及酶切鑒定確為重組植物雙元表達載體質(zhì)粒，命名為pBIN19-MBF1。4.再生番茄植株的獲得以AC＋＋番茄子葉為外植體，通

5、過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，將CaMV35S啟動子調(diào)控下的MBF1基因轉(zhuǎn)入番茄，經(jīng)過50mg/LKan及500mg/L的Sm篩選，獲得一部分生根的再生植株。VIIIABAAbscisicacid脫落酸AmpAmpicillin氨芐青霉素ATPAdenosinetriphosphate三磷酸腺苷BTMBasaltranscriptionalmachinery基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機器bZIPafamilyoftranscriptionfactorwithbasicregionandLeu-zippermotif帶有堿性

6、區(qū)域和亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子家族CARM1Coactivatorassociatedargininemethyltransferase1精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1CaMV35SCauliflowermosaicvirus35Spromoter花椰菜花葉病毒35S啟動子cDNAComplementaryDNA互補DNADNADeoxyribonucleicacid脫氧核糖核酸dNTPdeoxynucleotidetriphosphatesdATP/dTTP/dCTP/dGTP的混合物DREBDehydrationR

7、esponsiveElementBinding干旱應(yīng)答效應(yīng)元件EBEthidiumbromide溴化乙錠E.coliEscherichiacoli大腸桿菌EDTAEthylenediaminetetraceticacid乙二氨四乙酸REBP/AP2Ethylene-responsiveelement乙烯反應(yīng)因子GCNGiantcerebralneuron巨大腦神經(jīng)元HATHistoneacetyltransferase組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶HREHormoneresponseelement激素效應(yīng)元件IPT

8、GIsopropyl-β-D-thiogalactoside異丙基-β-D-硫代半乳糖苷KanKanamycin卡那霉素LBLuria-bertanimediaLB培養(yǎng)基MBF1Multiproteinbridgingfactor1多蛋白橋染因子mRNAmessengerRNA(ribonucleicacid)信使核糖核酸MSMurashigeandskoogmediumMS培養(yǎng)基MYBafamilyoftranscriptionfacto