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《川芎嗪對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞abc家族的抑制作用 (1)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文摘要第一部分人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系BEL-7402/ADM的建立一、人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株BEL-7402/ADM的建立方法：以文獻(xiàn)方法采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊誘導(dǎo)的模式，建立人肝癌BEL-7402/ADM耐藥細(xì)胞株。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本細(xì)胞6BEL-7402，常規(guī)消化細(xì)胞，按2×10個(gè)/瓶進(jìn)行分瓶，加入終濃度為50nmol/L的阿霉素（adriamycin，ADM），24h換液，用PBS沖洗，胰酶進(jìn)行消化，根據(jù)生長(zhǎng)情況選擇傳代周期。低濃度持續(xù)誘導(dǎo)，棄去上清和死亡懸浮的細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)液脫藥培養(yǎng)，在細(xì)胞重新生長(zhǎng)并達(dá)到覆蓋2/3瓶壁時(shí)，加
2、入含ADM濃度為2000nmol/L的培養(yǎng)液進(jìn)行大劑量沖擊誘導(dǎo)，待存活細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)增殖后，加入含ADM200nmol/L的培養(yǎng)液繼續(xù)誘導(dǎo)，同上步驟依次建立ADM誘導(dǎo)濃度為600﹑800﹑1000﹑2000nmol/L的人肝癌BEL-7402/ADM耐藥細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)最終采用ADM濃度為2000nmol/L的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的BEL-7402/ADM耐藥細(xì)胞為本次實(shí)驗(yàn)的耐藥細(xì)胞組。結(jié)果：成功誘導(dǎo)人肝癌耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM。倒置顯微鏡下人肝癌耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果，耐藥細(xì)胞多為分片狀、群集性增殖，細(xì)胞的多角性改變，棱角變少，呈梭形，胞漿的折光
3、性變大，細(xì)胞易被消化。二、MTT法測(cè)定人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系BEL-7402/ADM的耐藥倍數(shù)方法：取親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞，用0.25%胰酶消化處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用4含8%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，每孔接種200μL，即2×10個(gè)mL，接種在96孔板上，設(shè)有空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、ADM組、5-FU組、VCR組和CDDP組，以上給藥組均設(shè)5個(gè)濃度。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選定490nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，參比波長(zhǎng)為620nm。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率=（1－給藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%.公式計(jì)算IC50值：lgIC50=Xm-I[
4、P-(3-Pm-Pn)/4]，Xm：lg最大劑量；I：lg(最大劑量/相鄰劑量)；P：陽(yáng)性反應(yīng)率之和；Pm：最大陽(yáng)性反應(yīng)率；Pn：最小陽(yáng)性反應(yīng)率。耐藥倍數(shù)(RI)=4華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文(ICResistancegroup)/(ICParentalgroup)×100%.結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ADM對(duì)親本的BEL-7402以及耐藥的BEL-7402/ADM的IC50值分別是（1.47±0.28）、（7.62±0.51）μmol/L；5－FU的IC50值分別是（4.56±0.72）、（21.53±2.47）μmol/L；VCR的IC50值分別是(8.98±0.30)
5、、（80.27±11.22）μmol/L；CDDP的IC50值分別是(1.2±0.04)、（10.67±2.14）μmol/L，對(duì)各藥物的耐藥倍數(shù)分別為：ADM5.18倍、5-FU4.72倍、VCR8.94倍、CDDP8.89倍。三、ADM不同誘導(dǎo)濃度對(duì)人肝癌細(xì)胞系BEL-7402中P-gp表達(dá)的影響方法：以Western-blot法檢測(cè)在200、600﹑800﹑1000﹑2000nmol/L不同ADM濃度誘導(dǎo)至穩(wěn)定增殖的肝癌BEL-7402細(xì)胞的P-gp的表達(dá)。結(jié)果以各組P-gp/α-tublin與未誘導(dǎo)的親本細(xì)胞（control組）的比值百分率（均值±標(biāo)準(zhǔn)差，?X±S
6、D）表示。結(jié)果：以200、600﹑800﹑1000﹑2000nmol/L不同ADM濃度穩(wěn)定增殖的肝癌BEL-7402細(xì)胞，其P-gp的蛋白表達(dá)以親本細(xì)胞P-gp/α-tublin（control組）為100％計(jì)，分別為(99.37±1.63)、(112.36±1.59)、(105.01±1.93)、(102.12±1.16)、(102.84±2.18)％，其中阿霉素濃度為200nmol/L時(shí)，P-gp表達(dá)與control組無(wú)差異，但當(dāng)阿霉素濃度為600﹑800﹑1000﹑2000nmol/L時(shí)，蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。四、細(xì)胞周期分析方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEL-
7、7402、BEL-7402/ADM細(xì)胞于流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA含量并進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果：細(xì)胞周期結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞G0/G1縮短，而G2/M、S期增加（P<0.05）(n=3)。五、流式細(xì)胞儀檢測(cè)親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積方法：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEL-7402、BEL-7402/ADM細(xì)胞以8000nmol/L5華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文ADM培養(yǎng)2h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果：FCM檢測(cè)結(jié)果，以BEL-7402內(nèi)熒光強(qiáng)度為100％計(jì)，耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度為(82.08±6
