基因克隆載體1ppt培訓(xùn)課件

《基因克隆載體1ppt培訓(xùn)課件》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、第九章基因克隆載體通過不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細胞且能在其中維持的DNA分子。意義：基因工程隨載體系統(tǒng)的建立而興起，構(gòu)建新載體一直是基礎(chǔ)研究的優(yōu)先領(lǐng)域1、克隆位點(一個或多個)2、能攜帶外源DNA片段進入受體細胞:能自我復(fù)制，或整入染色體隨受體細胞DNA復(fù)制而復(fù)制3、有選擇克隆子的標(biāo)記基因4、安全性(不含損害受體的基因，不任意轉(zhuǎn)入別的，尤其人的細胞)按克隆載體的來源分：質(zhì)粒噬菌體質(zhì)粒-噬菌體DNA雜合載體人工染色體分類2質(zhì)粒克隆載體質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的性質(zhì)１、組成與構(gòu)型是染色體外裸露的雙鏈DNA分子（細菌

2、、真菌、藍藻、綠藻）l-DNAoc-DNAccc-DNA基本步驟：細菌生長和質(zhì)粒的擴增菌體收獲和溶菌質(zhì)粒純化質(zhì)粒的分離純化方法細菌培養(yǎng)質(zhì)粒擴增并表達蛋白質(zhì)大腸桿菌染色質(zhì)質(zhì)粒質(zhì)粒復(fù)制強度：緊密控制型(Stringentcontrol)松馳控制型(Relaxedcontrol)緊密控制型只在細胞周期的一定階段進行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時，它也不能復(fù)制，通常每個細胞內(nèi)只含有1個或幾個質(zhì)粒分子松馳控制型后者的質(zhì)粒在整個細胞周期中隨時可以復(fù)制，在每個細胞中有許多拷貝，一般在20個以上松馳控制型：10個以上拷貝；小質(zhì)粒。經(jīng)氯霉素處理，宿主

3、中質(zhì)粒大量擴增（如ColE1拷貝數(shù)達3000個）。3、質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性兩個細菌接觸，供體菌通過性菌毛將DNA直接轉(zhuǎn)入受體菌內(nèi)，使受體菌獲得新的遺傳性狀的過程親和性質(zhì)粒：能在同一細胞中穩(wěn)定共存的幾種質(zhì)粒不親和性（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細胞中穩(wěn)定共存的質(zhì)粒意義：宿主細胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒。４、質(zhì)粒的不相容性1、滅活質(zhì)粒轉(zhuǎn)移基因，杜絕污染事件，保證安全2、分子盡可能?。ㄞD(zhuǎn)化率高），轉(zhuǎn)化率↓3、克隆位點4、選擇標(biāo)記基因——抗性基因，報告基因5、組裝各種“元件”，如啟動子、終止子等6、構(gòu)建過程力求簡單二、質(zhì)

4、粒克隆載體構(gòu)建的基本策略pBR322及其衍生質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建p：質(zhì)粒（plasmid)BR：兩位主要構(gòu)建者322：實驗編號與pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個DNA片段（lacZ`基因）替換Tcr基因；組裝了一個多克隆位點（MCS）連桿pUC19質(zhì)粒載體α-互補含乳糖操縱子的啟動子、調(diào)節(jié)因子和β-半乳糖苷酶的N端146殘基(α-肽)合成有活性的基因（lacZ`）的質(zhì)粒載體引入可編β-半乳糖苷酶碼C端部分殘基的宿主(與LacZ`互補的大腸桿菌)實驗中使用IPTG以誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶操縱子。X-gal在β-半乳糖苷酶作用下生成

5、深藍色產(chǎn)物。實驗中使用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)而非直接使用β-半乳糖X-gal以及β-半乳糖均為β-半乳糖苷酶底物，但是X-gal不能誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶操縱子。藍白篩選酵母質(zhì)粒載體釀酒酵母中的2um環(huán)狀質(zhì)粒病毒基本結(jié)構(gòu)：DNA（或RNA）+外殼蛋白感染細菌的病毒，稱為噬菌體。分類（根據(jù)病毒與宿主的關(guān)系）：溫和性病毒：溶原性增殖→構(gòu)建病毒載體烈性病毒：溶菌性增殖→改造后噬菌體載體一、λ噬菌體克隆載體λ噬菌體性質(zhì)λDNA+外殼蛋白1、λDNA(48.5kb)

6、噬菌體中：線性宿主細胞：環(huán)狀(cos位點)λ噬菌體基因組有基因30個以上轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction概念：以噬菌體為媒介，將供體菌DNA片段轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)，使受體菌獲得新的遺傳性狀。3、限制性核酸內(nèi)切酶位點:56種（p477）4、λ噬菌體的生長途徑溶菌生長途徑溶原生長途徑λ噬菌體載體的構(gòu)建λ噬菌體本身存在著種種缺陷，必須對它進行多方面的改造，才能滿足理想載體的要求縮短野生型入DNA的長度，提高外源DNA片段的有效裝載量刪除重復(fù)的酶切位點，引入載體多克隆位點，增加外源DNA片段克隆的可操作性滅活某些與裂解周期有關(guān)的基因，使λ噬

7、菌體載體只能在特殊的實驗條件下感染裂解宿主細菌，避免可能出現(xiàn)的生物污染現(xiàn)象的發(fā)生引人合適的選擇標(biāo)記基噬菌體-質(zhì)粒雜合載體由質(zhì)粒和含cos位點的λDNA片段組裝成的載體，即cosmid人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)，包括YAC、BAC、PAC。染色體基本功能單位包括復(fù)制起始點(replicationorigin)、著絲粒(centromere)和端粒(telomere)。復(fù)制起始點，保證了染色體復(fù)制，著絲粒保證了染色體分離，端粒封閉了染色體末端，防止粘附到其他斷裂端，保證了染色體的穩(wěn)定存在第五節(jié)人工染色體克隆載

8、體酵母人工染色體是由復(fù)制起點、端粒和著絲粒構(gòu)成的線狀DNA最大優(yōu)點是能容納大分子外源DNA，平均在420kb左右，最大達1．0×10kb。作為一種有效的載體工具，YACs已經(jīng)廣泛用于各種生物基因組分析6酵母人工染色體載體系統(tǒng)YACs可容納調(diào)控元件構(gòu)建基因文庫基因治療基因功能鑒定人工染色體克