液相芯片技術(shù)在人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)中的應(yīng)用的研究

《液相芯片技術(shù)在人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)中的應(yīng)用的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、中文摘要本的篩查、監(jiān)視治療干預(yù)和評(píng)價(jià)疫苗效果【5’6】。近年來(lái)，隨著液相芯片技術(shù)的日漸成熟，其在病原微生物的基因診斷中也得到了廣泛應(yīng)用。研究?jī)?nèi)容：本研究利用LuminexTM技術(shù)平臺(tái)，選取與臨床感染密切相關(guān)的HPV23種高、低危型別(低危型包括HPV6，11，42，43，44等5種，高危型主要為HPVl6，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等18種)作為研究對(duì)象，選取23種型別的HPV樣本，經(jīng)測(cè)序及Blast驗(yàn)證為相應(yīng)型別，將各型別L1區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組克隆構(gòu)建質(zhì)粒庫(kù)，作為陽(yáng)性參照標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)計(jì)基因分型檢測(cè)系

2、統(tǒng)，并對(duì)HPV通用引物和探針進(jìn)行了篩選，建立PCR反應(yīng)體系、雜交反應(yīng)體系，對(duì)影響雜交反應(yīng)的因素進(jìn)行系統(tǒng)的分析，獲得最佳反應(yīng)條件。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果證明該方法可對(duì)HPV準(zhǔn)確分型。為確立陽(yáng)性診斷的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的多次檢測(cè)結(jié)果確定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及參考值。以構(gòu)建的HPV液相芯片基因分型系統(tǒng)對(duì)314例單一型和混合型臨床HPV感染樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以測(cè)序法作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)Luminex法的準(zhǔn)確度、特異性、靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)，為L(zhǎng)uminex法運(yùn)用于臨床HPV基因分型檢測(cè)做可行性研究。研究方法：1．構(gòu)建23個(gè)型別的HPV-L1區(qū)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)：通過(guò)查找genbank中待檢測(cè)的23種型別的HPV

3、序列，選擇Ll區(qū)的MY09／11引物擴(kuò)增區(qū)作為目標(biāo)序列。用HPV-PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)臨床收集的樣本進(jìn)行HPV檢測(cè)，對(duì)結(jié)果陽(yáng)性者進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)為23種待檢測(cè)的型別。將每種型別的MY09／11引物擴(kuò)增區(qū)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、重組克隆。對(duì)克隆質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序再鑒定，檢索GenBank，確認(rèn)為相應(yīng)型別。保存HPV6，11，42，43，44，16，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等23種型別的陽(yáng)性克隆。作為HPV分型的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)。2．HPV基因分型液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)的建立：PCR體系的建立：針對(duì)23種型別HPV的目標(biāo)檢測(cè)序

4、列，采用通用型引物Il碩士學(xué)位論文MY09／Il用于擴(kuò)增HPVL1區(qū)的高保守區(qū)，同時(shí)設(shè)計(jì)一條引物P8用于擴(kuò)增部分通用引物不能兼顧的型別。擴(kuò)增產(chǎn)物為450bp。內(nèi)參引物PCOI／02用于擴(kuò)增人13-Globin基因，對(duì)樣本提取及PCR過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控，產(chǎn)物大小為221bp。目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域及內(nèi)參片段的上游引物采用生物素標(biāo)記，以便于液相芯片雜交檢測(cè)。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品及樣本的擴(kuò)增對(duì)PCR體系各組份以及PCR程序進(jìn)行優(yōu)化獲得最佳擴(kuò)增條件。雜交體系的建立：根據(jù)HPV-LI區(qū)基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)針對(duì)23種HPV型別的特異性探針；同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)內(nèi)參13-Globin片段的質(zhì)控探針，對(duì)HPV分型檢測(cè)系統(tǒng)的樣

5、本提取及PCR過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控。探針5’端以氨基修飾，25條探針按照LuminexTM平臺(tái)技術(shù)方案分別偶聯(lián)至特定編碼的羧基微球上，制備成HPV分型檢測(cè)的液相芯片。通過(guò)與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交并以L(fǎng)uminexXM200進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)雜交體系的各組份及雜交溫度(45℃、50。C、55。C、58。C)進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)對(duì)多型標(biāo)準(zhǔn)品PCR產(chǎn)物的等比及不等比混合樣品的檢測(cè)，確定HPV基因分型液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)臨床混合型標(biāo)本的檢測(cè)性能；通過(guò)對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)品的5次檢測(cè)，確定檢測(cè)系統(tǒng)的重復(fù)性。3．參考值確定及質(zhì)控體系建立．根據(jù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果，確定判別檢測(cè)結(jié)果的參考值，并以感染率最高的HPVl6型

6、作為檢測(cè)系統(tǒng)的陽(yáng)性質(zhì)控品。檢測(cè)體系中的陽(yáng)性?xún)?nèi)參探針(PC)對(duì)樣本提取及PCR體系進(jìn)行質(zhì)控，顯色內(nèi)參探針(CC)對(duì)微球偶聯(lián)效率及雜交后顯色過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控。4．大樣本檢測(cè)對(duì)所建立液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)的性能評(píng)價(jià)：收集314例臨床樣本，為女性生殖道疾病患者及健康體檢者的尿道分泌物、宮頸脫落細(xì)胞或疣體細(xì)胞保存液。用煮沸法提取樣本DNA備用。以測(cè)序法作為驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，采用所建立的Luminex法對(duì)314例HPV樣本進(jìn)行基因分型檢測(cè)，同時(shí)所有樣本以測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。以測(cè)序法作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算，對(duì)Luminex法用于HPV分型檢測(cè)的靈敏度，特異性，準(zhǔn)確度等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。III中文摘要結(jié)果：1．

7、對(duì)臨床23種型別的HPV陽(yáng)性樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物重組克隆，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建了HPV6，1l，42，43，44，16，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)粒)。2．本研究建立的液相芯片系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)構(gòu)建的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，確定了PCR引物序列，以及PCR體系中各引物、DNA聚合酶、M92+、dNTPs等各組份的濃度和比例，并確定了PCR最適反應(yīng)程序。在確定的體系中，HPV擴(kuò)增區(qū)及內(nèi)參片