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《細胞核的分離與純化及RNA、DNA的定量測定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、喻娟娟生物化學與分子生物學教研室聯(lián)系電話:15836197257Email:yujuan8186@gmail.com細胞核的分離純化及RNA、DNA的定量測定實驗六1.了解細胞核分離純化的基本原理和方法2.掌握DNA、RNA定量測定的原理及方法3.掌握離心機的使用一、細胞核的分離與純化（上午）二、RNA的定量測定三、DNA的定量測定（下午）一、細胞核的分離與純化DNA、RNA在細胞中的分布：DNA胞核內(nèi)(98%)胞質(zhì)內(nèi)(2%)RNA胞核內(nèi)(10%)胞質(zhì)內(nèi)(90%)核酸的種類：DNA、RNA結(jié)論：DNA主要存在于細胞核，RNA主要存在于細胞質(zhì)。二、核酸的種類及其分布核酸核苷酸磷酸堿基戊糖定糖法（
2、戊糖的差異）三、核酸的鑒定濃HCl＋3H2O+β－D－核糖糠醛糠醛3，5－二羥基甲苯綠色化合物RNAＯＨˉ水解β－D－核糖+Pi+A.G.C.U地衣酚法:（1）核糖核酸RNA的測定DNAＨ＋水解β－D－２－脫氧核糖+Pi+A.G.C.U-H2O硫酸脫氧核糖ω－羥基－γ－酮基戊醛藍色化合物二苯胺法:（2）脫氧核糖核酸DNA的測定1、0.25mol/L蔗糖檸檬酸（含3.3mmol/LCaCl2） 稱取蔗糖86g及CaCl2363mg，用1.5％擰檬酸液溶解并稀釋至1000ml。2、0.88mol/L蔗糖檸檬酸液（含3.3mmol/LCaCl2） 稱取蔗糖301g及CaCl2363mg，用1.5％檸
3、檬酸液溶解并稀釋至1000ml。3、核洗液：即0.05mol/L，Tris—HCl（pH7.5）－0.15mol/LNaCl液。在0.2mol/LTris—HClpH7.5緩沖液250ml中加NaCl8.7g再用蒸餾水稀釋至1000ml。4、1.5％擰檬酸5、0.9％NaCl6、0.02NNaOH7、離心機8、水浴箱9、常規(guī)玻璃儀器試劑與器材用頸椎脫臼法殺死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，除去結(jié)締組織，盡快置于盛有0.9%NaCl的小燒杯中，反復洗滌，盡量除去血液。洗完后將肝臟一分為二，每個小組半個肝，直接將半個肝放在小燒杯里剪碎，剪碎的肝臟放入勻漿器中，加入1.5％檸檬酸鈉溶液4.5ml，反
4、復研磨制成勻漿，從而破碎細胞。研磨完后，將勻漿液用單層紗布進行過濾，以除去未研碎的組織。（1）肝細胞勻漿的制備（2）分離細胞質(zhì)和細胞核將過濾好的勻漿液，放入普通離心機，以3500r/min的轉(zhuǎn)速，離心15min。緩慢倒出上清液（細胞質(zhì)），移入另一試管中，保留待測定核酸時使用。余下的沉淀物為粗制的細胞核，加入0.25mol/L蔗糖-擰檬酸溶液1ml，用玻捧攪勻，制成細胞核懸液。另取離心管一支，先加入0.88mol/L蔗糖-檸檬酸液9ml，用滴管吸取上述核懸液，沿管壁緩緩鋪于0.88mol/L蔗糖-檸檬酸溶液液面上，再以2000r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘，傾去上層液，將管倒立于濾紙上，以吸干余液。
5、沉淀為初步純化的細胞核。加入Tris－HCl－NaCl核洗液5ml洗滌沉淀，以2000r/min離心10min，除去上層液。得到的白色沉淀即為純化的肝細胞核。加5ml0.02mol/L的NaOH使細胞核溶解為核液，保留，待測定核酸。0.88mol/L蔗糖-檸檬酸溶液9ml核懸液0.25mol/L0.88mol/L初步純化的細胞核其它的亞細胞結(jié)構(gòu)半個肝臟＋1.5%檸檬酸溶液4.5ml，制成勻漿單層紗布過濾1次濾液離心：3500r/min；15min上清液（保留！）沉淀加入0.25mol/L蔗糖檸檬酸溶液1ml核懸液沿壁緩鋪于9ml0.88mol/L蔗糖檸檬酸液面上離心：2000r/min；10m
6、in上清液（棄去）沉淀核洗液5ml洗滌沉淀上層液（棄去）沉淀純化的細胞核5ml0.02mol/LNaOH溶解細胞核待測樣品鑒定離心：2000r/min，10min細胞核的分離與純化實驗流程試劑（ml）12細胞質(zhì)液1.0-細胞核液-1.01mol/LKOH1.01.02.顯色與比色：取試管三支，編號，按下表操作:試劑（ml）12空白管細胞質(zhì)RNA水解液1.0--細胞核RNA水解液-2.0-5％三氯醋酸1.02.03,5一二羥基甲苯液3.03.03.01.水解：取試管二支，編號，按下表操作：混合各管沸水浴(10min)冷卻加入5%三氯醋酸(8ml)攪勻后離心2000r/min；5min上清液立即混
7、合各管沸水浴(10min)冷卻660nm比色測定二、RNA的定量測定試劑（ml）12細胞質(zhì)液2.0-細胞核液-2.01mol/L過氯酸2.02.0試劑（ml）12空白管細胞質(zhì)DNA水解液2.0--細胞核DNA水解液-2.0-0.5mol/L過氯酸2.0二苯胺試劑4.04.04.0混合各管冷卻離心上清液立即混合各管冷卻2000r/min;5min三、DNA的定量測定2.顯色與比色：取試管三支，編號，
