基因克隆技術(shù)的發(fā)展

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1、基因克隆技術(shù)的發(fā)展摘要基因克隆技術(shù)是生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域里非常重要的部分，為了縱覽基因克隆的理論和技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)新歷程，對各種技術(shù)體系，正向遺傳學(xué)途徑、反向遺傳學(xué)途徑進(jìn)行了綜述。隨著后基因組時(shí)代的到來，基因克隆技術(shù)將發(fā)揮更加重要的作用。關(guān)鍵詞功能性克隆同源序列技術(shù)表達(dá)克隆技術(shù)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽基因芯片電子克隆幾種模式生物基因組測序和人類基因組計(jì)劃的相繼完成，使人們對基因的研究很快進(jìn)入后基因組時(shí)代?；蚪M學(xué)時(shí)代的主要任務(wù)是圖譜制作性和序列測定，后基因組學(xué)時(shí)代則是進(jìn)行基因組功能注釋，這也是功能基因組學(xué)的主要研究目標(biāo)[1-2]。如何利用基因這一重要的資源，關(guān)于基因?qū)＠?/p>

2、權(quán)的建立和完善的基因爭奪大戰(zhàn)的硝煙也正在彌漫全球?？寺』虿粌H可以用來興旺生命科學(xué)工業(yè)(制藥業(yè)等)，改良農(nóng)作物、畜禽品種等，還可以對遺傳性疾病進(jìn)行基因治療，探索疾病的分子機(jī)制和生物發(fā)育調(diào)控規(guī)律?？寺』虻耐緩接袃煞N，正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)途徑。前者是依據(jù)目標(biāo)基因所表現(xiàn)的功能為基礎(chǔ)，通過鑒定其產(chǎn)物或某種表型突變而進(jìn)行的；后者則著眼于基因本身，通過特定的序列或在基因組中的位置進(jìn)行?；虻目寺∫话悴捎孟铝屑夹g(shù)：同源序列技術(shù)、差異表達(dá)基因分離技術(shù)、表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、基因芯片技術(shù)和電子克隆技術(shù)等。1.功能性克隆通過基因產(chǎn)物的克隆技術(shù)在傳統(tǒng)遺

3、傳學(xué)占主導(dǎo)地位的時(shí)代，人們以基因產(chǎn)物為導(dǎo)向來分離克隆基因。由于基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能已知，可通過分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，設(shè)計(jì)探針或引物從基因組DNA文庫或cDNA文庫中篩選克隆，也可以制備產(chǎn)物抗體，從表達(dá)載體構(gòu)建的cDNA文庫中篩選相應(yīng)克隆，進(jìn)而分離目的基因。若研究者可得到足夠多的純化目的蛋白以用于制備特異性抗體時(shí)，可以采用經(jīng)典的免疫篩選表達(dá)文庫的方法，篩選陽性克隆獲取其目的基因[3]。除了免疫篩選方法外，也可根據(jù)目的蛋白的生物學(xué)功能，利用同位素標(biāo)記的配體來篩選受體表達(dá)的陽性克隆。當(dāng)所分離的目的蛋白較難大量獲得，但純度較高時(shí)，

4、可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，據(jù)此合成寡核苷酸用于cDNA文庫的篩選；或根據(jù)所獲得的基因序列，指導(dǎo)5’端的引物合成，根據(jù)mRNA3’端poly—A序列指導(dǎo)合成poly—T的3’端引物，用PCR技術(shù)從制備細(xì)胞的mRNA或直接從胞漿內(nèi)溶物中合成相應(yīng)的cDNA，將該cDNA克隆到表達(dá)載體上進(jìn)行產(chǎn)物表達(dá)。1.同源性序列克隆技術(shù)隨著基因研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)幾乎所有的基因與其他的基因都有一定的聯(lián)系：生物的種、屬之間編碼基因序列的同源性高于非編碼區(qū)的序列。基于此原理，在其他種屬同源基因被克隆的前提下，構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫，然后用已知分

5、子高保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，并用簡并引物對含有目的基因的DNA文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和功能鑒定。對于同源性很高的基因，可以直接用作探針進(jìn)行非嚴(yán)謹(jǐn)性雜交篩選另一物種的DNA文庫。同源性序列克隆技術(shù)自提出以來，受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視，發(fā)展很迅速，但有些問題是值得重視和思考的：①由于密碼子的簡并性和不同同源序列間同源程度的差異，簡并引物的特異性要設(shè)計(jì)得當(dāng)，必要時(shí)需要設(shè)計(jì)幾套引物組合。②由于某些同源序列并不專屬于某一基因家族，因而擴(kuò)增產(chǎn)物不一定是某一基因家族成員。③基因家族成員往往成簇存在，克隆的基因片段是否為目的基因尚需進(jìn)

6、一步判斷。因此對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和克隆產(chǎn)物，有必要進(jìn)行基因與性狀共分離分析，插入失活或遺傳轉(zhuǎn)化等功能鑒定工作，以便最終篩選到目的基因。2.表型克隆技術(shù)細(xì)胞在增殖、分化、外界環(huán)境變化等某些異常狀態(tài)下(如癌變、異常增生)，常有某些新基因特異性表達(dá)或表達(dá)異常地增高，而另一些基因可能表達(dá)降低或缺失，因而分離差異表達(dá)基因?qū)⑹钦J(rèn)識生物體的生長發(fā)育等生命活動過程的入手點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)，才能深入理解基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)與調(diào)控。差異表達(dá)基因的分離方法也伴隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展由單一化發(fā)展為多元化，而且呈各種方法互相結(jié)合的趨勢。分離差異表達(dá)基因的3種基本方法為：差式篩選

7、[4]、扣除雜交[5-7]、差異展示反轉(zhuǎn)錄[8]。差式篩選法是分別從有特異表達(dá)基因的目標(biāo)樣和無特異表達(dá)基因的參照樣中提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并構(gòu)建Ts的cDNA文庫，分別將從TS和RS中提取mRNA制成cDNA探針，分別用TS和RS的eDNA探針與TScDNA文庫的菌落或噬菌斑作原位雜交，選出只與Ts雜交，而不與RS雜交的克隆即為TS特異表達(dá)的克隆。此法常要經(jīng)過多輪菌斑雜交，不僅費(fèi)力費(fèi)錢，重復(fù)性差，而且靈敏度很低?？鄢s交則是用TS提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA探針與Rs的過量mRNA或cDNA雜交，經(jīng)兩輪充分雜交后，移去雜交分子和過量的R

8、S的mRNA或cDNA，將不形成雜交體的TS的eDNA純化富集，擴(kuò)增，建立相應(yīng)cDNA文庫即為差異表達(dá)基因cDNA文庫。但