圖位克隆原理ppt課件.ppt

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1、圖位克隆原理簡(jiǎn)要說(shuō)明1在擬南芥的眾多生態(tài)型中最常用的三種是Landsbergerecta(Ler)Columbia(Col)Wassilewskija(Ws)其中Col生態(tài)型用于擬南芥的全基因組測(cè)序。2MarkerSSLPsCAPsdCAPsInDelSNP多態(tài)性3SSLP=simplesequencelengthpolymorphisms簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性又稱(chēng)SSR=simplesequencerepeats比較產(chǎn)物長(zhǎng)度4CAPs=cleavedamplifiedpolymorphicsequences酶切擴(kuò)增多態(tài)性利用酶切位點(diǎn)5Marker:MIG5

2、-BCLHC6dCAPs=derivedCAPS設(shè)計(jì)引物引入錯(cuò)配堿基，從而引入酶切位點(diǎn)7其它標(biāo)記InDel=insertion-deletion插入缺失標(biāo)記，指的是兩種親本中在全基因組中的差異，相對(duì)另一個(gè)親本而言，其中一個(gè)親本的基因組中有一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失。根據(jù)基因組中插入缺失位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一些擴(kuò)增這些插入缺失位點(diǎn)的PCR引物，這就是InDel標(biāo)記。部分SSLP就是由InDel轉(zhuǎn)化而來(lái)密度：每6.6kb存在一個(gè)8SNP=singlenucleotidepolymorphism單核苷酸多態(tài)性主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)

3、性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或顛換所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說(shuō)的SNP并不包括后兩種情況。(后面兩種情況的多態(tài)性一般歸為InDel）密度：每3.3kb存在一個(gè)9SSLPs10粗定位引物（更新）11粗定位引物（混合）121314F1父本染色體母本染色體15F1假設(shè)：Aa突變位點(diǎn)BbMarker突變?yōu)殡[性突變16F1配子長(zhǎng)根長(zhǎng)根長(zhǎng)根長(zhǎng)根長(zhǎng)根短根短根長(zhǎng)根長(zhǎng)根短根17F2短根個(gè)體Col單帶Ler單帶ColLer雙帶因?yàn)镕2代根據(jù)表型來(lái)篩選個(gè)體時(shí)，我們?nèi)斯みx擇的是短根表型，選擇的個(gè)體為短根aa，即突變

4、位點(diǎn)不可能存在交換，交換率=0其他位點(diǎn)可能存在交換，利用帶型差異判斷交換次數(shù)18wildtypemutant雜交ColLerF1plant圖中的兩個(gè)親本不但在A/a位點(diǎn)有差異，在其他位點(diǎn)也存在大量的遺傳差異，可以利用這些差異設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，對(duì)染色體的具體區(qū)段進(jìn)行標(biāo)定。在該例子中，該染色體上總共確定了5個(gè)分子標(biāo)記，標(biāo)定了5個(gè)不同區(qū)段。假設(shè)：Aa突變位點(diǎn)有5個(gè)Marker19只有左側(cè)三種植株會(huì)選入定位群體自交F2plants假設(shè)：只存在單交換20分子標(biāo)記M5與突變位點(diǎn)的遺傳距離：10/1006/1004/100(20/(100×2))×100%=10cMM5處

5、發(fā)生交換的植株包括三種情況假設(shè)：統(tǒng)計(jì)100個(gè)個(gè)體21分子標(biāo)記M4與突變位點(diǎn)的遺傳距離：6/1004/100(10/(100×2))×100%=5cM22分子標(biāo)記M3與突變位點(diǎn)的遺傳距離：4/100(4/(100×2))×100%=2cM23M4m4如何分辨來(lái)自于兩個(gè)親本的染色體？目前最常用的分子標(biāo)記是利用兩個(gè)親本中同一染色體區(qū)段的長(zhǎng)度差異來(lái)設(shè)計(jì)的，如左圖親本Ler的M4處染色體區(qū)段長(zhǎng)于親本Col中m4染色體區(qū)段，在該差異位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物就會(huì)有不同長(zhǎng)度，電泳后M4泳動(dòng)速度慢，m4泳動(dòng)速度快，因此通過(guò)電泳就可以分辨來(lái)自于兩個(gè)親本

6、的染色體區(qū)段24包含來(lái)自于兩個(gè)親本的染色體片段包含來(lái)自于Col兩條染色體區(qū)段包含來(lái)自于Ler兩條染色體區(qū)段注意后兩種情況反映的是來(lái)自于兩個(gè)配子的染色體區(qū)段的情況25Col*********1、4、8、10、11、13、15、18、19共9個(gè)樣品，只包含來(lái)自于親本Col的染色體區(qū)段，沒(méi)有發(fā)生交換26Ler***5、6、14共3個(gè)樣品，只包含來(lái)自于親本Ler的染色體區(qū)段，也就是發(fā)生了兩次交換27Col*******2、3、7、9、12、16、17共7個(gè)樣品，包含1個(gè)來(lái)自于親本Col的染色體區(qū)段以及1條來(lái)自于親本Ler的染色體區(qū)段，即發(fā)生了一次交換Ler28突

7、變位點(diǎn)與分子標(biāo)記M的遺傳距離：交換次數(shù)配子總數(shù)×100%3×2+719×2×100%≈34cM=293031SSLPs32SSLPs3340.48%20.00%4.76%4.76%12.5%12.5%36%34步驟總結(jié)篩選F2代短根移栽提基因組各對(duì)引物PCR統(tǒng)計(jì)計(jì)算Rf縮小范圍尋找新Marker擴(kuò)大群體(篩選重組子)3周左右35在突變位點(diǎn)附近區(qū)域內(nèi)絕大部分的樣品跑樣結(jié)果都應(yīng)該為只有非重組的Col條帶，即記錄Rf為0，只有少數(shù)的樣品存在交換，Rf記為1。圖中的6、12號(hào)樣品即為重組子什么是重組子36在篩選出6、12號(hào)兩個(gè)重組子以后，假設(shè)在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)尋找到新

8、的標(biāo)記引物，就不需要把所有的個(gè)體跑樣，只需要跑重組子個(gè)體例：篩選重組子的目的Rf