蝴蝶蘭類原球莖農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因體系構建

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1、分類號S682密級不保密UDC634全日制碩士專業(yè)學位研究生學位論文蝴蝶蘭類原球莖農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因體系構建作者姓名：于璇指導教師：崔永一教授專業(yè)學位名稱：農(nóng)業(yè)推廣碩士領域名稱：園藝研究方向：園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳育種農(nóng)業(yè)與食品科學學院、所在學院：動物科技學院（籌）論文提交日期：2015年12月21號浙江農(nóng)林大學2015年12月ZhejiangA&FUniversityDissertationfortheDegreeofMasterConstructionofPLBstransgenicsystemmediatedbyAgrobacteriumtumefa

2、ciensinPhalaenopsisorchidCandidate:YuXuanAdviser:CUIYong-yi,ProfessorSpecialty:HorticultureDateofSubmission:Dec,2015ZhejiangA&FUniversityLin’an,zhejiangprovince,P.R.ChinaDec,2015獨創(chuàng)性聲明本人聲明，所呈交的學位論文，是受國家自然科學基金項目“蝴蝶蘭生物鐘基因（DhGI1）的功能分析及調(diào)控網(wǎng)絡解析”資助，在指導教師指導下，通過我的努力取得的成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作

3、了標注和致謝中已經(jīng)作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含在浙江農(nóng)林大學或其他教育機構獲得學位或證書而使用過的材料。與我一同對本研究做出貢獻的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意。如被查有嚴重侵犯他人知識產(chǎn)權的行為，由本人承擔應有的責任。學位論文作者親筆簽名：日期：論文使用授權的說明本人完全了解浙江農(nóng)林大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即學校有權送交論文的復印件，允許論文被查閱和借閱；學?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文。保密，在年后解密可適用本授權書?！醪槐Ｃ?本學位論文屬于不保密。

4、□（請在方框內(nèi)打“√”）學位論文作者親筆簽名：日期：指導教師親筆簽名：日期：摘要蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)為蘭科蝴蝶蘭屬植物，其花色艷麗而豐富、形似蝴蝶而優(yōu)美，且花期長3~4個月之久，極具觀賞價值和經(jīng)濟價值，在國內(nèi)外市場廣受大眾喜愛。本試驗前期以蝴蝶蘭組培苗葉片為誘導材料，構建了一個較為穩(wěn)定的類原球莖誘導體系，為蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因試驗提供了受體材料。后期以蝴蝶蘭類原球莖和組培苗葉片為受體材料，研究了侵染液濃度，侵染時間，侵染添加物質(zhì)等多種因素對蝴蝶蘭遺傳轉(zhuǎn)化的影響，探索最佳遺傳轉(zhuǎn)化條件。并采用農(nóng)桿菌介導法成功地將目的基因轉(zhuǎn)入了蝴蝶蘭受體

5、材料，構建了蝴蝶蘭類原球莖轉(zhuǎn)基因體系，為后續(xù)導入目的外源基因及基因功能驗證等工作奠定基礎。主要研究結果如下：（1）蝴蝶蘭類原球莖誘導體系的建立最適葉片的選擇：生長4~5周，大小為8~12mm×10~13mm（葉寬×葉長）的蝴蝶蘭葉片是誘導PLB的較好選擇。葉基部的PLB誘導率、PLB數(shù)目、芽誘導率均最高，葉尖部和葉中部次之；故葉基部是誘導PLB的較好選擇。按不同規(guī)格切割的葉片當中，規(guī)格為10mm×3mm的葉片最多長出PLB，PLB誘導率達52.78%；其次是10mm×5mm的葉片，PLB誘導率達22.22%。蝴蝶蘭葉片誘導類原球莖最適培養(yǎng)基為：1/2MS+

6、TDZ0.2mg/L+BA4mg/L+CW20%+PVP3g/L+sucrose15g/L，Phytagel3g/L，pH為5.5，其PLB誘導率達47.21%，每個葉片上誘導出PLB數(shù)目平均值為8.15個。結果表明使用0~1mg/L的TDZ和0~4mg/L的BA對葉片誘導PLB都具有積極作用。（2）類原球莖的增殖與分化最適的類原球莖增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+ZT3mg/L+adeninesulfate10mg/L+CW15%+peptone2g/L+sucrose15g/L+AC1g/L，Phytagel3g/L，pH為5.5。最適的類原球莖分化培養(yǎng)基為

7、：花寶+BA3mg/L+CW15%+sucrose15g/L+PVP2g/L，Phytagel3g/L，pH為5.5。（3）農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因體系的構建I以蝴蝶蘭類原球莖為受體材料，采用植物表達載體為pCAMBIA1301（含gus報告基因和潮霉素抗性基因hpt），菌株為EHA105的根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）通過農(nóng)桿菌介導法成功構建蝴蝶蘭類原球莖轉(zhuǎn)基因體系。蝴蝶蘭類原球莖預培養(yǎng)2~3d，農(nóng)桿菌菌液OD為0.3，侵染時間為60min，共培養(yǎng)時間44~52h的轉(zhuǎn)化條件下，在含有10mg/L潮霉素、300mg/L羧芐青霉素的

8、篩選培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)55d后經(jīng)GUS、PCR檢測，轉(zhuǎn)化效率最佳，其