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1、植物基因克隆技術及其發(fā)展方向摘要：基因是染色體上具有一定座位的遺傳單位，是DNA分子中一定長度的核苷酸序列。植物的生長發(fā)育是在多種代謝和生理過程基礎上所發(fā)生的基因在時空上表達的綜合現(xiàn)象，開發(fā)和分離潛在的各種有價值的基因并深入研究其表達機理，對作物品種的改良具有重要意義。因此對植物基因的克隆并發(fā)展與之相關的技術已引起人們的日益關注和投入，近年來其研究方法不斷改進，新技術不斷涌現(xiàn)，這為進一步研究諸如各種調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的基因、逆境與防御反應的基因、植物細胞凋亡的基因等提供了新的途徑。關鍵詞：植物基因克隆基因植物基因轉(zhuǎn)化正文:植物基因的
2、克隆技術是生命科學研究的重要組成部分,是現(xiàn)代生命科學技術中最核心的內(nèi)容,它是隨著20世紀70年代初DNA體外重組技術的發(fā)明而發(fā)展起來的,其目標是識別和分離特異基因并獲得基因完整序列,確定其在染色體上的位置,闡明其生化功能,并利用生物工程手段應用到生產(chǎn)實踐中。一、常用的目的基因克隆技術 1、1、通過已知基因產(chǎn)物的分析和鑒定 這類技術主要通過生物化學和病理學研究分離鑒定有關基因的蛋白產(chǎn)物，并對蛋白質(zhì)氨基酸順序進行分析，推斷出編碼該蛋白質(zhì)的基因序列，然后通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對文庫進行篩選來分離目的基因。如植物抗
3、病蟲基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當其他植物的同類基因已分離到并且核苷酸序列保守性較高時，也可直接用這些已知的基因片段作探針對未克隆到該基因的植物基因文庫進行篩選，也可分離到未知的新基因?！ ?、通過遺傳表型分析 ?。?）基因標鑒法。該法是利用轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產(chǎn)生一些突變體，然后用相應轉(zhuǎn)座子或T-DNA對突變體文庫進行篩選，以選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫分離目的基因。如將一株帶有功
4、能的轉(zhuǎn)位因子系統(tǒng)的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交后代中篩選由于轉(zhuǎn)位因子插入到某一特定基因序列中導致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構(gòu)建基因文庫，然后將轉(zhuǎn)位因子用同位素標記作探針，從該文庫中篩選出帶有同源轉(zhuǎn)位因子的目的基因。該法主要限于二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚草等。應用該法已分離出與玉米種子發(fā)育有關的Viviparious-1基因及與金魚草花發(fā)育有關的一些基因等?！ 。?）激發(fā)子的寄主受體基因克隆技術。該技術是利用病菌無毒基因（avrgene）編碼的激發(fā)子與寄主抗病基因編碼的受體之間存在不親和的互作關
5、系，以病原激發(fā)子蛋白為線索分離和克隆出一些幾丁質(zhì)抗病基因，如番茄與無毒基因avr9對應的抗病基因cf9，與avrPto對應的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對應的抗病基因rpS2等?！ ?、以圖譜為基礎的定位克隆技術 以圖譜為基礎的定位克隆技術在分離未知產(chǎn)物的基因方面有廣闊的應用前景。該法的基本前提是基因定位，然后以緊密連鎖的分子標記如RFLP等為起點，通過染色體步移逐步向目標基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標基因定位在高密度的分子標記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷標記的遺傳圖譜距轉(zhuǎn)換成物理距離；（
6、3）構(gòu)建YAC文庫，找到含連鎖標記的YAC克隆，并通過克隆的排序獲得目標基因的DNA片段；（4）通過轉(zhuǎn)化和功能互補試驗證實基因所在的DNA片段。如用該技術已分離出番茄抗根結(jié)線蟲mi基因和擬南芥菜抗細菌性莖腐病的RPM1基因等。二、發(fā)展中的基因克隆新技術 1、1、從研究缺失突變體的表型著手分離基因 （1）核DNA消減法。該法主要是利用許多缺失突變體與其未缺失的同源親本只有1-2個DNA片段的差異，通過將大量特殊標記的突變體DNA與少量未缺失親本DNA相混合，變性后在適當溫度下復性，待反應體系中的單鏈DNA重新配對成雙鏈后，除去標
7、記的突變體DNA和與之雜交配對的親本DNA。如此幾輪選擇后，反應體系中最后只剩下在突變體核DNA中所缺失的那一段親本DNA，最后對親本特異DNA片段進行克隆?！ ?2)核DNA消減--PCR法。該法是核DNA消減法的發(fā)展，它將經(jīng)特定限制性內(nèi)切酶處理的未缺失親本DNA（備測DNA）與大量經(jīng)超聲波切割、光敏生物素標記的突變體DNA(減法探針DNA)混合，經(jīng)變性復性后加抗生物素蛋白包裹的多聚乙烯小球懸浮液除去各種雜合體，富集的親本特異性DNA再經(jīng)幾輪篩選后加接頭序列和T4DNA連接酶，然后加入單鏈接頭序列作PCR引物進行PCR擴增，最后
8、PCR產(chǎn)物直接克隆或32P標記后作探針與親本DNA或核DNA文庫雜交，確定出這些DNA片段所編碼的基因，應用上述方法已分離出擬南芥菜與赤霉素合成有關的基因gal以及冰草的鹽脅迫誘導基因等?！ ?、從大的基因組區(qū)域直接分離編碼序列 真核生物基因組D
