用于基因克隆的載體

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1、第三章用于基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特征3.1載體的功能及特征3.1.1載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件3.1.2載體應(yīng)具備的條件具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點(diǎn)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)3.2質(zhì)粒載體3.2.1質(zhì)粒的基本特征A:質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被

2、穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子；B:質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中；C:絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的；D:絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA；E:質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb。雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）3.2.2質(zhì)粒的分子形式3.2.2.1共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)CovalentclosecircularDNA呈超螺旋（SC）（supercoil）3.2.2.3線形DNA（linear，L-DNA）一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。3.2.2.2開環(huán)DNA（opencircular

3、，ocDNA）同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、LDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL3.2.2.4質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率3.2.3質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不

4、相容性群以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容3.2.4質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，復(fù)制時(shí)受各自拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，經(jīng)過若干復(fù)制和細(xì)胞分裂周期后仍能共處同一細(xì)胞內(nèi)。3.2.5質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性

5、菌的質(zhì)粒可分成兩大類：接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞，如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用如Col、R的其它成員某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由bom和mob基因決定。大腸桿菌接合（conjunction）3.2.6攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有

6、重要意義3.2.7質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。pSC1018.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr3.2.7.1天然質(zhì)粒的缺陷（1）分子量大，拷貝數(shù)低第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長9.1kb。但只有一個(gè)EcoRI切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr作為篩選標(biāo)志。（2）篩選標(biāo)記不理想ColE1質(zhì)

7、粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。可以通過插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點(diǎn)EcoRI正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。3.2.7.2理想載體條件A、較小的分子和較高的拷貝數(shù)B、多個(gè)單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)C、兩種以上的選擇標(biāo)記D、易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并復(fù)制和表達(dá)3.2.7.2質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理：氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四環(huán)素抗性（Tetr）鏈霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性

8、標(biāo)記：i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的衍生